细胞周期

总论

图1：有丝分裂基本过程

图2：小鼠的成纤维细胞分裂时会蜷缩成一团

图3：出芽酵母的芽的大小对应着其在细胞周期中的位置

图4：用人造核苷酸标记正在复制DNA的细胞

图5：用流式细胞仪检测每个细胞中DNA含量

• 所有真核生物都通过有丝分裂（Mitosis）和减数分裂（Meiosis）复制。（本文只讨论有丝分裂）
• 大多数细胞在有丝分裂时，核膜解体而细胞核外的中心体牵引染色体。
• 有些低等生物的细胞有丝分裂时，核膜不解体，中心体移至细胞核内牵引染色体，早期被误认为没有中心体，故称“无丝分裂”（Amitosis），此词现已废止。
• 高等生物的细胞发生细胞凋亡时，会破裂为许多碎片，称为凋亡小体，早期也曾被误认为一种“无丝分裂”。
• 草履虫行无性生殖时，只有小核DNA复制且有中心体牵引；大核只能随机将染色体分散至两个子细胞，可能是真核生物中唯一的“无丝分裂”。
• 从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束称为一个细胞周期（Cell Cycle）。
• 有丝分裂由S期和M期组成，S期发生DNA复制，M期发生细胞分裂。
• 上一次有丝分裂结束到下一次S期开始，之间的间隔称为G₁期。
• 从S期结束到M期开始，之间的间隔称为G₂期。
• S期很长，可达10-12 h；M期很短，只需不到1 h。
• 有些细胞需要等待很长时间甚至永远不进入S期，这些细胞称为处在G₀期。
• 有丝分裂基本过程见图1。
• 常用的研究有丝分裂的模式物种：出芽酵母（Saccharomyces Cerevisiae）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces Pombe）、爪蟾（Xenopus Laevis）、果蝇（Drosophila Melanogaster）。
• 观察有丝分裂的方法：
  • 小鼠的成纤维细胞在有丝分裂时会蜷缩成一团。（见图2左下角）
  • 观察出芽酵母的芽的大小可判断其在细胞周期中的位置。（图3）
  • 用荧光染料给DNA染色；或用抗体标记微管蛋白，可判断细胞在细胞周期中的位置。
  • 在培养基中加入溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine，一种人造核苷酸），可标记正在复制DNA的细胞。（图4）
  • 计算处在S期的细胞的比例，可知S期在细胞周期中大约比例。
  • 用流式细胞仪（Flow Cytometer）可检测每个细胞中DNA含量，从而知道处在S期和M期的细胞的比例。（图5）
  • 处在M期的细胞的比例，称为有丝分裂指数（Mitotic Index）。

细胞周期控制系统

图6：细胞周期控制系统

图7：常见Cdk和周期素

图8：各周期素在细胞周期中的浓度变化

图9：Cdk的激活

图10：APC/C和SCF酶的激活

图11：细胞周期调控蛋白的其它信息

• 动物的早期胚胎细胞中，细胞周期的每个过程都有固定时间，不会因为某个事件未完成而暂停。
• 大多数细胞都有一套复杂的信号通路，控制细胞周期各阶段间的转换。
• 细胞周期控制系统的核心是两类蛋白：周期素（Cyclin，又名细胞周期蛋白）和依赖周期素的激酶（Cyclin-dependent Kinase，下文简称Cdk）。
• 细胞周期的控制有三个关键点：
  1. 从G1期到S期，称为Start，脊椎动物中又名限制点（Restriction Point）。
  2. 从G2期到M期。
  3. 从中期到后期。
• Cdk与特定的周期素结合时，能磷酸化特定的蛋白质，从而推动细胞周期前进。
• 不同的周期素在细胞周期的不同阶段被合成或降解，其浓度有规律地起伏，故称“周期素”。
• 酵母细胞只有一种Cdk，它与不同周期素结合时变为不同构象。
• 脊椎动物有四种Cdk，分别记为Cdk1、Cdk2、Cdk4、Cdk6。
• 常见周期素有四类：
  1. G₁/S周期素在G₁期上升，促使细胞进入S期，在S期下降。
  2. G₁周期素帮助调控G₁/S周期素，在G₁期上升，在M期下降。（有些细胞没有此周期素）
  3. S周期素在G₁期上升，促进染色体复制，在M期下降。
  4. M周期素在S期上升，促进细胞进入M期，在M期下降。
• 周期素不仅有激活Cdk的功能，也有把它引导至特定蛋白质的功能。
• Cdk的完全激活不仅需要周期素，还需在结合周期素后被Cdk激酶（Cdk-activating Kinase，CAK）磷酸化。
• 若Cdk作用位点的顶部的一对氨基酸残基被Wee1酶磷酸化，则会抑制Cdk活性；Cdc25酶则能将它们脱磷酸化，促进Cdk活性。
• 若Cdk结合周期素后结合Cdk抑制蛋白（Cdk Inhibitor Protein，CKI），则会抑制Cdk活性。（p27蛋白是一种CKI）
• CKI主要被用于控制G₁/S和S周期素。
• 从中期到后期的转换主要不通过蛋白质磷酸化完成，而是通过周期体（Cyclosome，又名后期促进复合体，Anaphase-promoting Complex，或APC/C）将特定蛋白用泛素标记降解完成。
• APC/C降解的主要蛋白有：Securin（导致姐妹染色单体分离，见下文）、S周期素、M周期素。（但没有G₁周期素）
• APC/C通过与Cdc20蛋白（有丝分裂中期）或Cdh1蛋白（有丝分裂后期至G₁期）结合而激活。
• APC/C在G₁/S周期素上升时被关闭。
• 细胞周期中的另一个泛素标记酶是SCF，用于在G₁末期降解一些CKI蛋白，和在S期降解G₁/S周期素。
• SCF通过与F-box蛋白结合而激活。
• 关于细胞周期调控蛋白的其它信息见图11。

S期

图12：DNA复制的调控

图13：黏连蛋白可能是把两条染色单体绑在一起的

图14：DNA甲基化的三种状态

注：本文不讨论DNA复制的具体过程，它被留给另一篇文章。

• 染色体的复制起始点处，在细胞周期全程都有起始点识别复合体（Origin Recognition Complex，ORC）结合。
• M期结尾至G1期开头，Cdc6、Cdt1蛋白和ORC将无活性的DNA解旋酶装至起始点附近，与ORC组成预复制复合体（Prereplicative Complex，PreRC）。
• S-Cdk磷酸化特定蛋白，引起DNA解旋酶激活和DNA复制复合体装配。
• DDK（另一种激酶）磷酸化DNA解旋酶，亦促进DNA复制。
• 细胞防止DNA复制两次的措施：
  1. S-Cdk磷酸化ORC和Cdc6蛋白，阻止新DNA复制复合体产生。
  2. APC/C在G1期被关闭，防止它降解联会蛋白（Geminin），而联会蛋白抑制Cdt1蛋白。
  3. Cdt1蛋白与复制叉处的一个蛋白结合时会促进其降解。
• S-Cdk能促进核小体的4种组蛋白的合成，为染色质结构复制提供原料。
• 组蛋白被复制叉处的核小体组装因子分配到新复制出的染色质上。
• 染色质的表观修饰如何被复制尚未研究清楚。
  • DNA甲基化研究得较为清楚：
    • 哺乳动物有三种DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase）：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B。（DNMT2结构上与这几种酶类似，但它是tRNA甲基转移酶；DNMT3L参与DNA甲基化的调控，但它没有酶活性）
    • 若DNA的两条链都有甲基化修饰，称为完全甲基化的（Fully Methylated）。
    • 刚完成复制的DNA，其中一条链无甲基化修饰，称为半甲基化的（Hemimethylated）。
    • 若半甲基化的DNA被复制，则其中一条子DNA两条链都无甲基化修饰，称为非甲基化的（Ummethylated）。
    • 将非甲基化的DNA变为完全甲基化，需要从头甲基化酶（de novo Methyltransferase），一般由DNMT1完成。
    • 将半甲基化的DNA变为完全甲基化，需要维护甲基化酶（Maintenance Methyltransferase），一般由DNMT3A和DNMT3B完成。（但这两类酶也各能以较低活性完成另一类的工作）
    • DNMT3A主要修饰卫星片段，DNMT3B主要修饰常染色质。
    • 缺少DNMT3A的小鼠能出生，但不能产生生殖细胞，且患有无神经节性巨肠节（Aganglionic Megacolon）。
    • 缺少DNMT3B的小鼠在胚胎晚期死亡。
    • DNMT3A和DNMT3B同时缺少，或缺少DNMT1的小鼠在胚胎早期即死亡。
  • 组蛋白修饰如何复制研究得不清楚：
    • 原有的有修饰的组蛋白在DNA复制时被暂时取下，复制后每个会被随机装到两条子DNA的一条上，且另一条的对应位置一般是无修饰的组蛋白。
    • 目前鉴定出了一些酶，会在DNA复制结束时修饰组蛋白，但尚不知它们如何获取模板，另外不是所有组蛋白修饰的酶都被发现。
    • 有种理论认为，组蛋白修饰不是完全在DNA复制时进行的，而是部分在基音转录时进行。
• 复制出的两条染色体通过黏连蛋白（Cohesin）结合在一起。（此时两条染色体各称为染色单体，结合在一起组成的结构称为一条染色体）
• 黏连蛋白具有环状结构，可能是通过这个环把染色单体绑在一起。（图13）
• 染色单体结合的另一方式是通过DNA缠绕（Catenation）。
• 在M期，拓扑异构酶II将缠绕的两条DNA链解开。
• S期中心粒会复制，由G1/S-Cdk启动，但两个中心粒仍被包在一个中心体中。

M期

图15：M-Cdk的激活

图16：前期核膜的变化

图17：凝缩蛋白

图18：三种纺锤丝

图19：四种马达分子

图20：染色体经多次尝试才能正确地与纺锤丝相连

图21：张力是保持正确连接稳定的原因

图22：从中期到后期

图23：染色体向中心体移动时，微管正极解体

图24：中体

图25：收缩环的启动

图26：收缩环位置确定的三种理论

• M期有两个主要事件：核分裂（Mitosis）、胞质分裂（Cytokinesis）。
• M期可分为两部分：由M-Cdk主导的部分、由APC/C主导的部分。
• M期在形态上可分为五部分：前期（Prophase）、前中期（Prometaphase）、中期（Metaphase）、后期（Anaphase）、末期（Telophase）。
• 核分裂贯穿M期全程，胞质分裂只在末期进行，M-Cdk主导的部分和APC/C主导的部分的分界点为中期和后期的分界点。
• 在G₂期，M周期素的转录和合成增多，但此时Cdk被Wee1酶磷酸化抑制，因此M-Cdk会积累，但无活性。（在动物胚胎细胞中则M周期素转录和合成量不变）
• 通过一个尚不清楚的机制，在G₂期末，Cdc25酶的活性突然上升，将Cdk酶脱磷酸化激活，引起M-Cdk活性突然上升，细胞进入M期。
• 激活的M-Cdk会抑制Wee1酶和激活Cdc25酶，进一步促进M-Cdk活性上升。
• M期初，还有两种重要的激酶：Polo激酶、Aurora激酶。
• 前期：
  • 植物细胞的细胞核要先移动至细胞中央，有时称为预前期（Preprophase）。
  • 为防止姐妹染色单体分离时被拉断，细胞投入巨大的能量浓缩染色质，形成染色体。
  • 浓缩染色质是通过凝缩蛋白（Condensin）实现的。（图17）
  • 染色质浓缩的同时，拓扑异构酶II将两条染色单体整理为易于分开的结构，必要时去除少量黏连蛋白。
  • 中心体周围开始组织纺锤丝，植物细胞中染色体周围开始组织纺锤丝。（见下文）
  • 去除中心体的细胞仍能正常分裂。
  • 中心体中γ-tubulin含量增加，称为中心体成熟（Centrosome Maturation）。
  • 纺锤丝由微管组成，MTOC处是负极，分三种：（图18）
    1. 极间微管（Interpolar Microtubule）：两个MTOC伸出的极间微管的正极相互结合。
    2. 动粒微管（Kinetochore Microtubule）：微管的正极和染色体的动粒（Kinetochore）结合。
    3. 星状微管（Astral Microtubule）：微管的正极与细胞膜结合，用于固定。
  • 与纺锤丝相关的马达分子有5种：（图19）
    1. Kinesin-5有2个马达亚基，分别与极间微管的2条微管结合，并分别向正极移动，它把2条微管推开。
    2. Kinesin-14有1个马达亚基和1个固定的与微管结合的亚基，它也与极间微管的2条微管结合，把2条微管拉紧。
    3. Kinesin-4和Kinesin-10有1个马达亚基，同时与染色体结合，负责将染色体推至微管末端。
    4. Dynesin有1个马达亚基，同时与细胞膜下的肌动蛋白结合，负责将MTOC拉至细胞两极。
  • Aurora和Polo激酶可磷酸化中心体的蛋白质，促进中心体成熟。
  • M-Cdk和Aurora激酶可磷酸化Kinesin-5蛋白，促进中心体分离。
  • 核仁消失。
• 前中期：
  • 动物和植物细胞中核膜解体或半解体。（被认为是M-Cdk磷酸化核孔复合体引起的）
  • 真菌的中心体在核膜上，核膜不解体或半解体。（图16）
  • 解体的核膜融入内质网。
  • 纺锤丝开始和染色体上的着丝粒（Kinetochore）相连。
  • 微管的不稳定性增大，微管骨架重组加速，适应于捕捉姐妹染色单体。（此现象在前期开始，但在前中期和中期较为明显）
  • 染色体附着有GEF蛋白（Guanine Nucleotide Exchange Factor），它促使附近的Ran蛋白与GTP结合而不是GDP。
  • Ran-GTP能分解某种蛋白复合体，释放微管稳定因子，从而使染色体附近的微管骨架稳定，易于捕捉姐妹染色单体。
  • 无中心体的细胞（包括植物细胞）主要依靠染色体稳定微管的能力组织微管，组织好的微管随后被一些马达分子接管。
  • 纺锤丝和染色体相连后，染色体所受拉力有三种：
    1. 动粒处的马达分子的拉力。（这一拉力不消耗ATP，其能量来自微管解体释放的能量，最终来源于微管聚合时水解的GTP）
    2. 中心体处微管解体并拉动后面的微管，称为微管流动（Microtubule Flux）。
    3. Kinesin-4和Kinesin-10将染色体向纺锤丝末端推，称为极风（Polar Wind）。
• 中期：
  • 当所有的着丝粒都与两极的纺锤丝相连时，细胞进入中期。
  • 动物细胞的着丝粒可与10-40根微管相连，而酵母细胞的着丝粒只能与1个相连。
  • 纺锤丝与着丝粒外部的杆状蛋白复合体Ndc80相连。
  • 染色体一般先与纺锤丝侧面接触，然后被马达分子推至纺锤丝末端。
  • 染色体一般不会一次就正确地与两极的纺锤丝相连，而是经多次尝试，不正确的连接方式高度不稳定。（图20）
  • 着丝粒内部有Aurora激酶，能磷酸化Ndc80，促使Ndc80和微管分离。
  • 若着丝粒与纺锤丝正确相连，纺锤丝的拉力使Ndc80远离Aurora激酶，防止它被磷酸化，所以正确的连接方式稳定。（图21）
  • 最终，染色体因受到两极大小相近的拉力而静止在细胞中央，所有染色体组成的平面称为赤道板（Metaphase Plate）。
• 后期：
  • 未正确与纺锤丝相连的着丝粒会引起Mad2蛋白构象改变。
  • 构象不正确的Mad2蛋白会抑制Cdc20蛋白，从而抑制APC/C复合体。
  • 当所有染色体正确排列在赤道板上时，Cdc20抑制解除，APC/C被激活。
  • APC/C降解保全素（Securin），激活之前与之结合的分离酶（Separase）。
  • 分离酶降解黏连蛋白，从而分离姐妹染色单体。（图22）
  • 一般以所有姐妹染色单体分离为后期开始。
  • APC/C降解S和M周期素。
  • 秋水仙碱（Colchicine）、长春碱（Vinblastine）能阻碍微管聚合，阻止细胞进入后期，也可阻止姐妹染色单体分离，使染色体加倍。
  • 后期可分为A和B两部分，略有重叠。
  • 后期A：微管正极解散，将染色体向两极拉动。
  • 后期B：中心体自身向两极移动，将染色体向两极拉动。
• 末期：
  • 内质网上分离出核膜，将两极的染色体包裹成核。
  • 核仁重新出现。
• 胞质分裂：
  • 在后期，细胞中间开始出现收缩环（Contractile Ring）。
  • S和M周期素降解能促进收缩环形成，保证它在正确时间形成。
  • 收缩环主要由肌动蛋白、肌球蛋白II组成，还有其它结构和调控蛋白。
  • 收缩环与细胞膜上的蛋白结合，逐渐收缩。
  • 一般以收缩环收缩至细胞膜突然出现明显凹痕（胚胎学中称为卵裂沟（Cleavage Furrow））作为胞质分裂开始，一般在末期。
  • 收缩环收缩的同时，蛋白不断减少，保持粗细不变。
  • 细胞膜面积增大的部分由来自高尔基体的囊泡提供。
  • 最后，收缩环解散，两个子细胞中间通过中体（Midbody）相连。（图24）
  • 一部分微管不随中心体移动至子细胞中，留在中体形成中心纺锤体（Central Spindle）。
  • 中体仍会继续收缩，至两个细胞完全分离，中心纺锤体一般移入其中一个子细胞。
  • 收缩环由RhoA激酶启动，见图25。
  • 收缩环的位置确定有三种理论，见图26：（多数细胞使用的方式是这三种理论的混合体）
    1. 星状微管刺激（Astral Stimulation）：在细胞膜上的固定点位于细胞中间的星状微管，能与促进收缩环形成的调控蛋白结合。
    2. 中心纺锤体刺激（Central Spindle Stimulation）：极间微管与若干信号分子结合，其中一种能激活RhoA。
    3. 星状微管松弛（Astral Relaxation）：星状微管对细胞膜有拉力，而细胞中间处受到的拉力最小，特定蛋白能感受此拉力。
  • 酵母细胞在G1期末有胞裂蛋白（Septin）聚集在细胞特定部位，提前确定了收缩环位置。
  • 植物细胞不通过收缩环分裂细胞，而是在细胞中间构建新细胞壁。
  • 植物细胞在后期，部分微管在细胞中间构建成膜体（Phragmoplast）。
  • 来自高尔基体的囊泡沿着成膜体的微管在细胞中间形成细胞板（Cell Plate）。
  • 囊泡的主要成分为果胶（Pectin）、少量糖蛋白，无纤维素。
  • 细胞板最终成为中胶层（Middle Lamella）。