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总论

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图1:多种多样的细菌染色方法

  • 细菌有多种染色方法,其中最重要的是革兰氏染色法(Gram's Stain)。
  • 染色可分为正染(Positive Staining)和负染(Negative Staining):
    • 正染:对细菌的细胞进行染色,环境不被染色。
    • 负染:对细菌生活的环境进行染色,细胞不被染色。
  • 正染的染料与细胞可通过离子键、共价键、疏水键结合。
  • 最常用的正染染料通过离子键与细胞结合,分为酸性染料、碱性染料。
    • 酸性染料:伊红(Eosin)、二碘曙红(玫瑰红,Rose Bengal)、酸性品红(Acid Fuchsin)。
    • 碱性染料:亚甲蓝(Methylene Blue)、碱性品红(Basic Fuchsin)、结晶紫(龙胆紫,Crystal Violet)、番红(Safranin)、品绿(孔雀绿,Malachite Green)。
  • 只使用一种染料的染色方法称为简单染色(Simple Stain)。
  • 使用多种染料分类染色的方法称为分化染色(Differential Stain)。
  • 常见的分化染色:革兰氏染色、抗酸染色(Acid-fast Stain)。
  • 有些染色方法专门用于染色特定结构:
    • 荚膜染色法(Capsule Staining):用墨汁(India Ink)或苯胺黑(Nigrosin)染色,背景比荚膜染色较深,属于负染。(观察硫细菌细胞内的硫颗粒亦可用此法)
    • 芽孢染色法(Endospore Staining):一般用Schaeffer-Fulton法。将细菌与品绿共热,用水脱染,用番红复染,属于正染,分化染色。
    • 鞭毛染色法(Flagellate Staining):用铝钾矾(硫酸铝钾)或鞣酸(Tannic Acid)包裹鞭毛(增粗),然后用副蔷薇苯胺(副玫瑰红,Pararosaniline)或碱性品红染色,属于正染。

固定细胞

  • 给细菌染色的第一步是固定细胞。
  • 固定细胞的方法有:热固定法(Heat Fixation)、化学固定法(Chemical Fixation)。
  • 热固定法:将细胞薄层在本生灯(Bunsen Burner)上微热,会破坏细胞内部结构。(较常用)
  • 化学固定法:在细胞薄层上滴加乙醇、乙酸、氯化汞、乙醛或戊二醛,不会破坏细胞内部结构。

革兰氏染色

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图2:革兰氏染色法

实验过程

  1. 取一个载玻片,用硼砂粉末擦拭,冲洗干净,用纸巾擦干。
  2. 在载玻片上3处各滴一滴蒸馏水。(也可只滴2处,见下文)
  3. 在本生灯上加热接种环至红热,冷却。
  4. 将接种环浸入培养基,再浸入其中一滴蒸馏水,重复直至这滴蒸馏水变为轻微浑浊。
  5. 将接种环埋入酒精浸没的沙子中,再在本生灯上加热至红热,去除残留细菌细胞。(不浸入沙子直接加热会有轻微爆炸声)
  6. 用革兰氏阳性菌(如葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)接种另外两滴蒸馏水,作为对照。(如果只滴2处,把革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌混合在同一滴中)
  7. 等待载玻片风干。(约5-10分钟,不能加热,否则破坏细菌)
  8. 载玻片干后,用镊子夹住载玻片快速通过本生灯火焰2-3次,微热固定细菌。(载玻片底部摸起来不能烫)
  9. 初染:将载玻片用结晶紫完全覆盖,静置6-30 s,倒掉染料,用蒸馏水冲洗5秒。(细菌已被固定,不需担心细菌流失)
  10. 媒染:将载玻片用碘液完全覆盖,静置12-60 s,倒掉染料,用蒸馏水冲洗5秒。(革兰氏阳性菌中,碘和结晶紫组成复合体,卡在细胞壁和内膜之间)
  11. 脱染:将载玻片用镊子斜45°夹住,滴加丙酮或乙醇,至不再滴出紫色染料,立刻用蒸馏水冲洗。(本步时间很关键,最好1-2 s,最多5 s)
  12. 复染:将载玻片用番红或其它染料完全覆盖,静置10-30 s,倒掉染料,用蒸馏水冲洗。
  13. 用纸巾吸去载玻片上的水。(但不能擦拭)
  14. 在显微镜下观察结果。(最好用油浸润显微镜)

实验结果

  • 被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌(Gram-positive Bacteria)。
  • 被染成红色的细菌称为革兰氏阴性菌(Gram-negative Bacteria)。
  • 大多数革兰氏阳性菌属于厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)。
  • 支原体(Mycoplasma)属于厚壁菌门,却是革兰氏阴性菌。
  • 奇异球菌(Deinococcus)不属于上述两个门,却是革兰氏阳性菌。
  • 实验结果错误的三个关键原因:
    • 细菌培养时间过长,革兰氏阳性菌会变成阴性菌。(原因不明)
    • 脱染时间过长,革兰氏阳性菌会呈现阴性菌。
    • 被染色的细菌悬浮液过浓,染色会不均匀。(培养基中的悬浮液一般很稀,不用担心此问题)

抗酸染色法

实验过程

  1. 在载玻片上准备材料,参考革兰氏染色。
  2. 初染:将载玻片用碳酸复红(Carbofuchsin)覆盖3-5 min,不用加热,然后冲洗。
  3. 脱染:滴加酒精-HCl溶液,10-30 s后冲洗。
  4. 复染:滴加甲基蓝,20-30 s后冲洗。
  5. 干燥后在油浸润显微镜下观察。

实验结果

  • 支原体被染为粉红色,其它细菌被染为蓝色。

细菌细胞结构染色法

荚膜染色法

  • 在载玻片上滴一滴细菌悬浮液,再滴一滴墨汁。
  • 轻轻放下盖玻片,要让两滴液体混合,且形成墨汁的浓度梯度。
  • 在显微镜下寻找,可找到黑色背景下荚膜呈现白色。
  • 因为这个过程不会杀死细菌,观察结束后要高温处理载玻片。

芽孢染色法

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