總論
圖1：多種多樣的細菌染色方法
- 細菌有多種染色方法，其中最重要的是革蘭氏染色法（Gram's Stain）。
- 染色可分為正染（Positive Staining）和負染（Negative Staining）：
- 正染：對細菌的細胞進行染色，環境不被染色。
- 負染：對細菌生活的環境進行染色，細胞不被染色。
- 正染的染料與細胞可通過離子鍵、共價鍵、疏水鍵結合。
- 最常用的正染染料通過離子鍵與細胞結合，分為酸性染料、鹼性染料。
- 酸性染料：伊紅（Eosin）、二碘曙紅（玫瑰紅，Rose Bengal）、酸性品紅（Acid Fuchsin）。
- 鹼性染料：亞甲藍（Methylene Blue）、鹼性品紅（Basic Fuchsin）、結晶紫（龍膽紫，Crystal Violet）、番紅（Safranin）、品綠（孔雀綠，Malachite Green）。
- 只使用一種染料的染色方法稱為簡單染色（Simple Stain）。
- 使用多種染料分類染色的方法稱為分化染色（Differential Stain）。
- 常見的分化染色：革蘭氏染色、抗酸染色（Acid-fast Stain）。
- 有些染色方法專門用於染色特定結構：
- 莢膜染色法（Capsule Staining）：用墨汁（India Ink）或苯胺黑（Nigrosin）染色，背景比莢膜染色較深，屬於負染。（觀察硫細菌細胞內的硫顆粒亦可用此法）
- 芽孢染色法（Endospore Staining）：一般用Schaeffer-Fulton法。將細菌與品綠共熱，用水脫染，用番紅復染，屬於正染，分化染色。
- 鞭毛染色法（Flagellate Staining）：用鋁鉀礬（硫酸鋁鉀）或鞣酸（Tannic Acid）包裹鞭毛（增粗），然後用副薔薇苯胺（副玫瑰紅，Pararosaniline）或鹼性品紅染色，屬於正染。
固定細胞
- 給細菌染色的第一步是固定細胞。
- 固定細胞的方法有：熱固定法（Heat Fixation）、化學固定法（Chemical Fixation）。
- 熱固定法：將細胞薄層在本生燈（Bunsen Burner）上微熱，會破壞細胞內部結構。（較常用）
- 化學固定法：在細胞薄層上滴加乙醇、乙酸、氯化汞、乙醛或戊二醛，不會破壞細胞內部結構。
革蘭氏染色
圖2：革蘭氏染色法
實驗過程
- 取一個載玻片，用硼砂粉末擦拭，沖洗乾淨，用紙巾擦乾。
- 在載玻片上3處各滴一滴蒸餾水。（也可只滴2處，見下文）
- 在本生燈上加熱接種環至紅熱，冷卻。
- 將接種環浸入培養基，再浸入其中一滴蒸餾水，重複直至這滴蒸餾水變為輕微渾濁。
- 將接種環埋入酒精浸沒的沙子中，再在本生燈上加熱至紅熱，去除殘留細菌細胞。（不浸入沙子直接加熱會有輕微爆炸聲）
- 用革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）接種另外兩滴蒸餾水，作為對照。（如果只滴2處，把革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌混合在同一滴中）
- 等待載玻片風乾。（約5-10分鐘，不能加熱，否則破壞細菌）
- 載玻片干後，用鑷子夾住載玻片快速通過本生燈火焰2-3次，微熱固定細菌。（載玻片底部摸起來不能燙）
- 初染：將載玻片用結晶紫完全覆蓋，靜置6-30 s，倒掉染料，用蒸餾水沖洗5秒。（細菌已被固定，不需擔心細菌流失）
- 媒染：將載玻片用碘液完全覆蓋，靜置12-60 s，倒掉染料，用蒸餾水沖洗5秒。（革蘭氏陽性菌中，碘和結晶紫組成複合體，卡在細胞壁和內膜之間）
- 脫染：將載玻片用鑷子斜45°夾住，滴加丙酮或乙醇，至不再滴出紫色染料，立刻用蒸餾水沖洗。（本步時間很關鍵，最好1-2 s，最多5 s）
- 復染：將載玻片用番紅或其它染料完全覆蓋，靜置10-30 s，倒掉染料，用蒸餾水沖洗。
- 用紙巾吸去載玻片上的水。（但不能擦拭）
- 在顯微鏡下觀察結果。（最好用油浸潤顯微鏡）
實驗結果
- 被染成紫色的細菌稱為革蘭氏陽性菌（Gram-positive Bacteria）。
- 被染成紅色的細菌稱為革蘭氏陰性菌（Gram-negative Bacteria）。
- 大多數革蘭氏陽性菌屬於厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）。
- 支原體（Mycoplasma）屬於厚壁菌門，卻是革蘭氏陰性菌。
- 奇異球菌（Deinococcus）不屬於上述兩個門，卻是革蘭氏陽性菌。
- 實驗結果錯誤的三個關鍵原因：
- 細菌培養時間過長，革蘭氏陽性菌會變成陰性菌。（原因不明）
- 脫染時間過長，革蘭氏陽性菌會呈現陰性菌。
- 被染色的細菌懸浮液過濃，染色會不均勻。（培養基中的懸浮液一般很稀，不用擔心此問題）
抗酸染色法
實驗過程
- 在載玻片上準備材料，參考革蘭氏染色。
- 初染：將載玻片用碳酸復紅（Carbofuchsin）覆蓋3-5 min，不用加熱，然後沖洗。
- 脫染：滴加酒精-HCl溶液，10-30 s後沖洗。
- 復染：滴加甲基藍，20-30 s後沖洗。
- 乾燥後在油浸潤顯微鏡下觀察。
實驗結果
- 支原體被染為粉紅色，其它細菌被染為藍色。
細菌細胞結構染色法
莢膜染色法
- 在載玻片上滴一滴細菌懸浮液，再滴一滴墨汁。
- 輕輕放下蓋玻片，要讓兩滴液體混合，且形成墨汁的濃度梯度。
- 在顯微鏡下尋找，可找到黑色背景下莢膜呈現白色。
- 因為這個過程不會殺死細菌，觀察結束後要高溫處理載玻片。
芽孢染色法
待編寫